in silico Protocol: PC022
ライゲーション
編集DNAプールに表示中のDNA塩基配列のうち、選択した２つのDNAをライゲーションにより結合します。また、１つのDNAを選択し、それをセルフライゲーションすることも可能です。ライゲーション対応のDNA末端の形状が保存されているため、末端同士のライゲーション可能性をチェックすることも選択できます。この場合は、末端同士の形状と配列が相補的でない場合は、ライゲーションの産物は生成されません。
- DNA両末端の形状を表示
- ライゲーション対象のDNAの末端形状がリスト上にわかりやすく表示されます
- 逆方向のインサート
- 両端が同じ形状と相補配列をもつDNA同士の産物は2種生成されます
- 制限酵素やPCR産物を直接ライゲーション
- インサートの確認
- プラスミドマップを描画して、インサートを確認する方法以外に、ゲル電気泳動によって、確認する方法もあります。
以下のインシリコ実験には、xxxを使用
試薬・装置
方法
- 予め読み込むか、あるいは制限酵素処理、PCR操作などで直線状のDNAを用意する
- ライゲーションボタンをクリックする
- IMCに読み込んである全部のDNAがLigation Dialogにリスト表示される 1st: ライゲーション対象の第１DNAフラグメント 2nd: ライゲーション対象の第2DNAフラグメント Fig.: DNAフラグメントが環状か直線状かを表示 Name: DNAフラグメントのファイル名 Length: DNAフラグメントの塩基長 5'End Type: 5' 側の末端形状 3' End Type: 3' 側の末端形状 （緑色の塩基は実際にはないことを示す）
- 直線状のDNAフラグメント中から１ｓｔ、2ndの２つのライゲーション対象を選択する。末端チェックをしないで無条件にライゲーションする場合は、End Checkをはずす。
- Ligation Dialog 下部のLiaationボタンをクリックする
- 確認メッセージが表示されるので、OKボタンをクリックする
- Ligation が実行され、その産物のリストが表示される
- 保存かつLoadしたいLigation産物にすべてチェックする
- Loadボタンをクリックして、Ligation産物をLoadする
- この時、最初に選択された産物のGenBankファイルが保存され、次にDNA編集プールにLoadされる。
- 保存先のディレクトリ・フォルダー（およびファイル名）を指定する。
- ファイルの保存およびLoadが実行され、確認メッセージが表示さえるので、「了解」をクリックする
- 選択したライゲーション産物がDNA編集プール上にLoadされる
インサートの入ったDNAのプラスミドマップを描画・印刷する
- ライゲーション産物をクリックして、そのFeatura Mapを表示する
- プラスミドマップボタンをクリックする
- インサート選択Dialogが表示される
- インサートDNAがどちらであるか、選択し、Setボタンをクリックする。
- Insertの入ったプラスミドマップのPreviewが表示される
インサートチェックのために最適な制限酵素をみつけ、更に指定した制限酵素を用いて消化切断した場合のゲル電気泳動シミュレーション結果を表示する
- Ligation Products List Dialogにおいて、１つ以上のライゲーション産物にチェックし、「Search Enzyme..」ボタンをクリックする
- Insert Checkに有効な制限酵素のリストが表示される
- ゲル電気泳動シミュレーションを行う制限酵素にすべてチェックします。
- ゲル電気泳動シミュレーション結果が表示される
