in silico Protocol: PC014

線状ＤＮＡのセルフライゲーションによる環状ＤＮＡ化

平滑末端をもつ線状ＤＮＡをセルフライゲーションにより、環状ＤＮＡとします。また、環状ＤＮＡを突出末端を形成する制限酵素で消化した後、セルフライゲーションを行うことにより、再度環状化が可能です。環状化の場合は新たなファイルの生成はありません（参考：開環の場合は新規ファイルが生成されます）。

以下のインシリコ実験には、IMCを使用

試薬・装置

１．全ゲノム断片塩基配列ファイル（＊、＊＊）：例（Bsub_50kbL.gbk)

２．環状プラスミドベクター　Expression_vector_pColdIV.gbk

３．実行ソフトウェア：IMCSE/GE/AE

＊DNA塩基配列は、Genbank、EMBLなどのサイトからダウンロード可能です。

＊＊例はインストール時のサンプルに含まれています。isb/imc/samples

方法

１．塩基配列ファイル読み込みボタンをクリックし、ファイル選択ダイアログから微生物全ゲノムDNA塩基配列(Bsub_50kbL.gbk)をIMCに読み込みます。

２．IMCメイン画面左側の反応チューブに線形のDNAアイコンが表示されます。

３．縮尺が適当でない場合は、ズームボタンとスクロールボタンで調整します。

４．ライゲーションボタンをクリックします。

５．ライゲーション反応ダイアログのSelf Ligationにチェックを入れます。するとSecond Fragmentのプルダウンメニューが不活化されます。

６．ライゲーション対象のFirst Fragment ＤＮＡファイルをさきほど読み込んだBsub_50kbL.gbkとします。そして、Ligationボタンをクリックします。何も制限酵素処理をうけていない配列ファイルは平滑末端とみなされますので、End Checkを入れていてもライゲーション可能です。

７．線状のアイコンは環状のアイコンとなり、５‘側上流へのスクロールができるようになります。

８．粘着末端のセルフライゲーションは、環状プラスミドを突出末端をもつ制限酵素で切断してから、セルフライゲーションを行います。

９．次に、環状プラスミドベクターを制限酵素BamHIで開環します。

１０．制限酵素サイトを確認して、実際に消化します。すると、新規に直鎖状のファイルが生成され、反応チューブには新しい直線状のアイコンが出現します。この直鎖状のベクターの総塩基長は環状の場合のサイズと比較して４塩基分長くなっています。これは両端の突出部分の塩基配列情報を保持するためです。

１１．直鎖状となったベクターを再度セルフライゲーションします。この断片は、制限酵素BamHIで消化されている末端同士ですから、ライゲーション可能です。

１２．ライゲーションが完了すると、直鎖状であったベクターのアイコンが環状に変化します。ベクターの塩基長は元の塩基数に戻っています

このように、環状ベクターを制限酵素で直鎖化し、再度セルフライゲーションを行うと元の環状ベクターが再現されることが判ります。