in silico Protocol:PC002

インシリコPCR

クローニングの準備の１つとして、ゲノムDNAの特定領域をPCRで増幅します。PCRには増幅領域の両側のDNA塩基配列に相補的な２つのプライマー塩基配列が必要です。

以下のインシリコ実験には、IMCを使用

IMCのすべてのEditionで実行可能です。

実行に必要なもの

鋳型DNA塩基配列ファイル（＊）　：　例（Bsub_50kb.gbk）
- 鋳型DNA塩基配列は、Genbank、EMBLなどのサイトからダウンロード可能です
プライマー塩基配列（＊＊）　：例（primer_sample_Bsub.dat）
- プライマーは新規に入力することや、他のソフトウェアからコピーすることが可能です。
実行ソフトウェア：IMC SE/GE/AE
- 上記の配列ファイルは、はIMCのSampleに登録されています。

方法

塩基配列ファイル読み込みボタンをクリックし、ファイル選択ダイアログから鋳型DNA塩基配列(例の場合はBsub_50kb.gbk)をIMCに読み込みます。
IMCメイン画面左側の反応チューブに円形あるいは線形のDNAアイコンが表示されます。
ズームアウトボタンを何回かクリックすると以下と同様のマップが見えてきます。
プライマー塩基配列がすでに登録されている場合はプライマー登録ボタンをクリックして、プライマー登録画面を開きます。
ここに目的のプライマーセットがない場合は、別のプライマーファイル（例の場合はprimer_sample_Bsub.dat）を読み込みます。読み込み方は、Readボタンをクリックします。すると、ファイル選択ダイアログが表示されるので、プライマーファイル（例の場合は、primer_sample_Bsub.dat)を指定し、開きます。
プライマーセットがあった場合にはそのままこの画面をCloseします。
ツールボックスのPCRボタンをクリックします。
するとプライミングサイト検索画面が開きます。
このリストにはこのプライマーファイルに予め登録されているすべてのプライマーが表示されます。
このリストの中から使用するフォワードおよびリバースプライマーを１つずつチェックします。例の場合は、BsubPrimerFWとBsubPrimerRVにチェックします。
PCRの範囲を限定したい場合は、検索画面の下部のFrom欄とTo欄に範囲を指定します。デフォールトでは読み込んだDNAファイルの全域がプライミングサイトの検索対象となります。
ここで、Reactionボタンをクリックすると、プライミングサイト画面が開きます。
プライミングサイト画面の左側にはプライマー別にDNA塩基配列上に発見されたプライミングサイトの数が表示されます。DNA上でユニークなプライミングサイトが必要な場合は、これらは１でなければなりません。１でない場合は、原則としてプライマーを代える必要があります。
しかし、IMCでは１つのプライマーが２箇所以上のプライミングサイトをもっていても、ユニークなPCRプロダクトを生成することができます（プロトコルXX参照）
各プライマーのプライミングサイトが１箇所ずつであった場合には、左のリストのそれぞれのプライマーにチェックします。すると、右側のリストにプライミングサイトの塩基配列位置と方向が表示され、同時にフィーチャーマップにもプライミングサイトの位置がマークされます。
ここで、画面下部のAmplifyボタンをクリックします。
すると、PCRの実行を確認するダイアログが表示されるので、これにYesを応えます。
すると増幅される断片のリストが表示されます。この場合は、1個の断片が増幅されます。
本来は、全部の断片が増幅されますが、IMCの場合は、増幅し、反応チューブ（編集プール）にLoadする断片を選択することができます。
Loadボタンをクリックすると、このPCR断片が反応チューブ（編集プール）にロードされ、登録されます。
このとき、ファイル保存ダイアログが表示され、生成されたPCRプロダクトファイルをどのようなファイル名で保存するかを指定します。
デフォールトファイル名は、DNAファイル名、フォワードプライマー名、リバースプライマー名をアンダースコア（＿）で連結したもので、さらに最後に数字５桁の連番が付加されます。拡張子はgbkとなりますが、.emblとすると、EMBLフォーマットで出力されます。保存ボタンをクリックすると保存されます。
生成されたPCRプロダクトは同時に反応チューブにも線状のアイコンで表示されます。これをクリックするとそのマップが表示されます。
このPCRプロダクトをベクターにインサートしてクローニングを行うにはプロトコルXXを参照してください。